PCR-reaktioiden häiriötekijät

PCR-reaktion aikana kohdataan usein joitain häiritseviä tekijöitä.
PCR:n erittäin korkean herkkyyden vuoksi kontaminaatiota pidetään yhtenä tärkeimmistä PCR-tuloksiin vaikuttavista tekijöistä ja se voi tuottaa vääriä positiivisia tuloksia.
Yhtä kriittisiä ovat erilaiset lähteet, jotka johtavat vääriin negatiivisiin tuloksiin. Jos yksi tai useampi olennainen osa PCR-seosta tai itse monistusreaktio estyy tai häiriintyy, diagnostinen määritys voi haitata. Tämä voi johtaa tehokkuuden heikkenemiseen ja jopa vääriin negatiivisiin tuloksiin.
Eston lisäksi kohdenukleiinihapon eheyden menetys voi tapahtua kuljetus- ja/tai varastointiolosuhteiden vuoksi ennen näytteen valmistusta. Erityisesti korkeat lämpötilat tai riittämätön varastointi voivat johtaa solujen ja nukleiinihappojen vaurioitumiseen. Solujen ja kudosten kiinnittyminen ja parafiiniin upottaminen ovat hyvin tunnettuja syitä DNA:n fragmentoitumiseen ja jatkuvaan ongelmaan (katso kuvat 1 ja 2). Näissä tapauksissa edes optimaalinen eristäminen ja puhdistus ei auta.

Kuva 1 | Immobilisaation vaikutus DNA:n eheyteen
Agaroosigeelielektroforeesi osoitti, että ruumiinavausten parafiinileikkeistä eristetyn DNA:n laatu vaihteli huomattavasti. Uutteissa oli eri keskimääräisiä fragmenttipituuksia kiinnitysmenetelmästä riippuen. DNA säilyi vain, kun se oli kiinnitetty natiivipakastettuun näytteeseen ja puskuroituun neutraaliin formaliiniin. Voimakkaasti happaman Bouin-fiksaattorin tai puskuroimattoman, muurahaishappoa sisältävän formaliinin käyttö johti merkittävään DNA-häviöön. Jäljelle jäävä fraktio on erittäin pirstoutunut.
Vasemmalla fragmenttien pituus ilmaistaan ​​kiloemäspareina (kbp)

Kuva 2 | Nukleiinihappokohteiden eheyden menetys
(a) 3'-5' aukko molemmissa säikeissä johtaa katkeamiseen kohde-DNA:ssa. DNA:n synteesi tapahtuu silti pienessä fragmentissa. Kuitenkin, jos DNA-fragmentista puuttuu alukkeen pariutumiskohta, tapahtuu vain lineaarinen monistuminen. Edullisimmassa tapauksessa fragmentit voivat kyllästää toisiaan uudelleen, mutta saannot ovat pieniä ja alle havaitsemistason.
(b) Emästen menetys, joka johtuu pääasiassa depurinaatiosta ja tymidiinidimeerin muodostumisesta, johtaa H-sidosten lukumäärän vähenemiseen ja Tm:n laskuun. Pidentyneen lämpenemisvaiheen aikana alukkeet sulavat pois matriisi-DNA:sta eivätkä pariudu edes vähemmän tiukoissa olosuhteissa.
(c) Vierekkäiset tymiiniemäkset muodostavat TT-dimeerin.
Toinen yleinen ongelma, joka usein esiintyy molekyylidiagnostiikassa, on kohdenukleiinihappojen vähemmän kuin optimaalinen vapautuminen fenoli-kloroformiuuttoon verrattuna. Äärimmäisissä tapauksissa tämä voi liittyä vääriin negatiivisiin tuloksiin. Paljon aikaa voidaan säästää kiehuvalla lyysillä tai solujätteen entsymaattisella digestiolla, mutta tämä menetelmä johtaa usein alhaiseen PCR-herkkyyteen riittämättömän nukleiinihapon vapautumisen vuoksi.

Polymeraasiaktiivisuuden esto monistuksen aikana

Yleensä estoa käytetään säiliökonseptina kuvaamaan kaikkia tekijöitä, jotka johtavat suboptimaalisiin PCR-tuloksiin. Tarkkaan biokemiallisessa mielessä esto rajoittuu entsyymin aktiivisuuteen, ts. se vähentää tai estää substraatti-tuotekonversiota vuorovaikutuksen kautta DNA-polymeraasin aktiivisen kohdan tai sen kofaktorin kanssa (esim. Mg2+ Taq DNA-polymeraasille).
Näytteen komponentit tai erilaiset reagensseja sisältävät puskurit ja uutteet voivat inhiboida suoraan entsyymiä tai vangita sen kofaktoreita (esim. EDTA), mikä inaktivoi polymeraasin ja johtaa puolestaan ​​alentuneisiin tai vääriin negatiivisiin PCR-tuloksiin.
Kuitenkin monia vuorovaikutuksia reaktiokomponenttien ja kohteen sisältävien nukleiinihappojen välillä kutsutaan myös "PCR-estäjiksi". Kun eristäminen rikkoo solun eheyden ja nukleiinihappo vapautuu, näytteen ja sitä ympäröivän liuoksen ja kiinteän faasin välillä voi esiintyä vuorovaikutuksia. Esimerkiksi "savengerit" voivat sitoa yksi- tai kaksijuosteista DNA:ta ei-kovalenttisten vuorovaikutusten kautta ja häiritä eristämistä ja puhdistusta vähentämällä PCR-reaktioastiaan lopulta pääsevien kohteiden määrää.
Yleensä PCR-estäjiä on useimmissa kehon nesteissä ja reagensseissa, joita käytetään kliinisissä diagnostisissa testeissä (urea virtsassa, hemoglobiini ja hepariini veressä), ravintolisät (orgaaniset komponentit, glykogeeni, rasva, Ca2+-ionit) ja ympäristön komponentit (fenolit, raskasmetallit)

Yleisempiä PCR-estäjiä löytyy bakteereista ja eukaryoottisoluista, ei-kohde-DNA:sta, kudosmatriisien DNA:ta sitovista makromolekyyleistä ja laboratoriovälineistä, kuten käsineistä ja muoveista. Nukleiinihappojen puhdistaminen uuttamisen aikana tai sen jälkeen on edullinen menetelmä PCR-estäjien poistamiseksi.
Nykyään erilaiset automatisoidut uuttolaitteet voivat korvata monia manuaalisia protokollia, mutta 100-prosenttista talteenottoa ja/tai kohteiden puhdistamista ei ole koskaan saavutettu. Mahdollisia inhibiittoreita saattaa edelleen olla läsnä puhdistetuissa nukleiinihapoissa tai ne voivat olla jo vaikuttaneet. On olemassa erilaisia ​​strategioita inhibiittoreiden vaikutuksen vähentämiseksi. Sopivan polymeraasin valinnalla voi olla merkittävä vaikutus estäjäaktiivisuuteen. Muita todistettuja menetelmiä PCR-estämisen vähentämiseksi ovat polymeraasipitoisuuden lisääminen tai lisäaineiden, kuten BSA:n, käyttö.
PCR-reaktioiden esto voidaan osoittaa käyttämällä sisäistä prosessin laadunvalvontaa (IPC).
On huolehdittava siitä, että kaikki uuttosarjan reagenssit ja muut liuokset, kuten etanoli, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanoli ja fenoli, poistetaan nukleiinihappoisolaatista perusteellisella pesuvaiheella. Konsentraatiostaan ​​riippuen ne voivat aktivoida tai estää PCR:n.