Häiriötekijät PCR -reaktioissa

PCR -reaktion aikana joitain häiritseviä tekijöitä esiintyy usein.
PCR: n erittäin korkean herkkyyden vuoksi kontaminaatiota pidetään yhtenä tärkeimmistä tekijöistä, jotka vaikuttavat PCR -tuloksiin ja voi tuottaa vääriä positiivisia tuloksia.
Yhtä kriittisiä ovat erilaisia ​​lähteitä, jotka johtavat vääriin negatiivisiin tuloksiin. Jos yksi tai useampi PCR -seoksen tai itse monistusreaktion olennainen osa estetään tai häiritä, diagnoosimääritys voidaan estää. Tämä voi johtaa vähentyneeseen tehokkuuteen ja jopa vääriin negatiivisiin tuloksiin.
Eston lisäksi kohde -nukleiinihapon eheyden menetys voi tapahtua kuljetus- ja/tai varastointiolosuhteiden vuoksi ennen näytteen valmistusta. Erityisesti korkeat lämpötilat tai riittämätön varastointi voi johtaa solujen ja nukleiinihappojen vaurioihin. Solujen ja kudosten kiinnitys ja parafiinin upottaminen ovat hyvin tunnettuja syitä DNA: n fragmentoinnille ja jatkuvalle ongelmalle (katso kuviot 1 ja 2). Näissä tapauksissa edes optimaalinen eristäminen ja puhdistus eivät auta.

Kuva 1 | Immobilisaation vaikutus DNA: n eheyteen
Agaroosigeelielektroforeesi osoitti, että ruumiinavausten parafiinileikkeistä eristetyn DNA: n laatu vaihteli huomattavasti. Erilaisten keskimääräisten fragmenttien pituuden DNA oli läsnä uutteissa kiinnitysmenetelmästä riippuen. DNA säilytettiin vain, kun se kiinnitettiin natiiviin jäädytettyihin näytteisiin ja puskuroituun neutraaliin formaliiniin. Vahvan happaman bouinin kiinnitys- tai puskuroimattoman, muurahaishappoa sisältävän formaliinin käyttö johti merkittävään DNA: n menetykseen. Jäljellä oleva osa on erittäin pirstoutunut.
Vasemmalla puolella fragmenttien pituus ilmenee kilobase -pareissa (KBP)

Kuva 2 | Nukleiinihappokohteiden eheyden menetys
(A) 3'-5'-rako molemmilla juosteilla johtaa taukoon kohde-DNA: ssa. DNA: n synteesiä esiintyy edelleen pienessä fragmentissa. Jos DNA -fragmentista puuttuu alukkeiden hehkutuspaikka, tapahtuu vain lineaarinen monistus. Suotuisimmassa tapauksessa fragmentit voivat asentaa toisiaan uudelleen, mutta saannot ovat pieniä ja alapuolella havaitsemistasoja.
(b) Pohjojen menetys, pääasiassa depuraation ja tymidiinidimeerin muodostumisen vuoksi, johtaa H-sidosten lukumäärän vähentymiseen ja TM: n laskuun. Pitkänomaisen lämpenemisvaiheen aikana alukkeet sulavat pois matriisi -DNA: sta eivätkä hehku edes vähemmän tiukissa olosuhteissa.
(c) Viereiset tymiinin emäkset muodostavat TT -dimeerin.
Toinen yleinen ongelma, joka esiintyy usein molekyylidiagnostiikassa, on kohde-nukleiinihappojen vähemmän optimaalinen vapautuminen verrattuna fenolikloroformin uuttoon. Äärimmäisissä tapauksissa tämä voi liittyä vääriin negatiivisiin. Paljon aikaa voidaan säästää kiehuvalla hajotuksella tai solujätteiden entsymaattisella pilkkomisella, mutta tämä menetelmä johtaa usein alhaiseen PCR -herkkyyteen, joka johtuu riittämättömästä nukleiinihapon vapautumisesta.

Polymeraasiaktiivisuuden estäminen monistuksen aikana

Yleensä estämistä käytetään säiliökonseptina kuvaamaan kaikkia tekijöitä, jotka johtavat optimaalisiin PCR -tuloksiin. Tiukasti biokemiallisessa mielessä estäminen rajoittuu entsyymin aktiivisuuteen, ts. Se vähentää tai estää substraattituotteen muuntamista vuorovaikutuksen avulla DNA-polymeraasin tai sen kofaktorin aktiivisen kohdan kanssa (esim. Mg2+ Taq-DNA-polymeraasille).
Näytteen komponentit tai erilaiset puskurit ja reagensseja sisältävät uutteet voivat suoraan estää entsyymin tai ansaan sen kofaktorit (esim. EDTA), inaktivoida siten polymeraasin ja puolestaan ​​johtavat vähentyneisiin tai vääriin negatiivisiin PCR -tuloksiin.
Kuitenkin monet reaktiokomponenttien ja kohteita sisältävien nukleiinihappojen väliset vuorovaikutukset on myös nimetty 'PCR-estäjiksi'. Kun solun eheys häiriintyy eristämisellä ja nukleiinihappo vapautuu, näytteen ja sen ympäröivän liuoksen ja kiinteän faasin väliset vuorovaikutukset voivat tapahtua. Esimerkiksi 'Scavengers' voi sitoa yksi- tai kaksijuosteisen DNA: n ei-kovalenttisten vuorovaikutusten kautta ja häiritä eristämistä ja puhdistusta vähentämällä PCR-reaktioastian lopulta saavuttavien kohteiden lukumäärää.
Yleensä PCR -estäjiä esiintyy useimmissa kehon nesteissä ja reagensseissa, joita käytetään kliinisiin diagnostisiin testeihin (virtsassa, hemoglobiini ja hepariini veressä), ruokavalio -lisäravinteet (orgaaniset komponentit, glykogeeni, rasva, Ca2+ -ioni) ja ympäristössä (fenolit, raskaat metallit))

Yleisempiä PCR-estäjiä voidaan löytää bakteereista ja eukaryoottisoluista, ei-kohde-DNA: sta, kudosmatriisien ja laboratoriolaitteiden, kuten käsineiden ja muovien, DNA: ta sitovista makromolekyyleistä. Nukleiinihappojen puhdistaminen uuttamisen aikana tai sen jälkeen on edullinen menetelmä PCR -estäjien poistamiseksi.
Nykyään erilaiset automatisoidut uuttamislaitteet voivat korvata monia manuaalisia protokollia, mutta 100%: n palauttamista ja/tai kohteiden puhdistamista ei ole koskaan saavutettu. Potentiaalisia estäjiä voi edelleen olla läsnä puhdistetuissa nukleiinihapoissa tai ne ovat jo voineet olla voimassa. Inhibiittorien vaikutuksen vähentämiseksi on olemassa erilaisia ​​strategioita. Sopivan polymeraasin valinnalla voi olla merkittävä vaikutus estäjän aktiivisuuteen. Muut todistetut menetelmät PCR -estämisen vähentämiseksi ovat polymeraasipitoisuuden lisääminen tai lisäaineiden, kuten BSA: n, soveltaminen.
PCR -reaktioiden estäminen voidaan osoittaa käyttämällä sisäistä prosessin laadunvalvontaa (IPC).
Kaikkien uuttopakkauksen, kuten etanolin, EDTA: n, CETAB: n, LICL, GUSCN: n, SDS: n, isopropanolin ja fenolin, kaikkien reagenssien ja muiden liuosten poistamiseksi nukleiinihappo -isolaatista perusteellisella pesuvaiheella. Niiden pitoisuudestaan ​​riippuen ne voivat aktivoida tai estää PCR: ää.