Interferenssitekijät PCR-reaktioissa

PCR-reaktion aikana esiintyy usein häiritseviä tekijöitä.
PCR:n erittäin korkean herkkyyden vuoksi kontaminaatiota pidetään yhtenä tärkeimmistä PCR-tuloksiin vaikuttavista tekijöistä, ja se voi tuottaa vääriä positiivisia tuloksia.
Yhtä kriittisiä ovat erilaiset lähteet, jotka johtavat vääriin negatiivisiin tuloksiin. Jos yksi tai useampi PCR-seoksen tai itse monistusreaktion olennainen osa estyy tai häiriintyy, diagnostinen määritys voi vaikeutua. Tämä voi johtaa tehokkuuden heikkenemiseen ja jopa vääriin negatiivisiin tuloksiin.
Eston lisäksi kohdenukleiinihapon eheys voi kärsiä näytteen valmistusta edeltävien kuljetus- ja/tai säilytysolosuhteiden vuoksi. Erityisesti korkeat lämpötilat tai riittämätön säilytys voivat johtaa solujen ja nukleiinihappojen vaurioitumiseen. Solujen ja kudosten kiinnittäminen ja parafiiniin upottaminen ovat tunnettuja DNA:n fragmentoitumisen syitä ja jatkuva ongelma (katso kuvat 1 ja 2). Näissä tapauksissa edes optimaalinen eristäminen ja puhdistaminen eivät auta.

Kuva 1 | Immobilisaation vaikutus DNA:n eheyteen
Agaroosigeelielektroforeesi osoitti, että ruumiinavausten parafiinileikkeistä eristetyn DNA:n laatu vaihteli huomattavasti. Uutteissa oli eripituisia keskimääräisiä fragmentteja riippuen kiinnitysmenetelmästä. DNA säilyi vain, kun se kiinnitettiin natiiveihin pakastettuihin näytteisiin ja puskuroituun neutraaliin formaliiniin. Voimakkaasti happaman Bouin-fiksatiivin tai puskuroimattoman, muurahaishappoa sisältävän formaliinin käyttö johti merkittävään DNA:n menetykseen. Jäljelle jäänyt fraktio on erittäin fragmentoitunut.
Vasemmalla fragmenttien pituus ilmaistaan ​​kiloemäspareina (kbp).

Kuva 2 | Nukleiinihappokohteiden eheyden menetys
(a) 3′-5′-aukko molemmissa juosteissa johtaa kohde-DNA:n katkeamiseen. DNA:n synteesi tapahtuu silti pienessä fragmentissa. Jos DNA-fragmentista kuitenkin puuttuu alukkeen kiinnittymiskohta, tapahtuu vain lineaarista monistusta. Suotuisimmassa tapauksessa fragmentit voivat kyllästää toisensa uudelleen, mutta saannot ovat pieniä ja havaitsemisrajojen alapuolella.
(b) Emästen menetys, pääasiassa depurinaation ja tymidiinidimeerin muodostumisen vuoksi, johtaa H-sidosten määrän vähenemiseen ja Tm:n laskuun. Pitkittyneen lämpenemisvaiheen aikana alukkeet sulavat irti matriisi-DNA:sta eivätkä kiinnity toisiinsa edes vähemmän tiukoissa olosuhteissa.
(c) Vierekkäiset tymiiniemäkset muodostavat TT-dimeerin.
Toinen yleinen ongelma molekyylidiagnostiikassa on kohdenukleiinihappojen heikompi vapautuminen kuin optimaalinen fenoli-kloroformiuuttoon verrattuna. Äärimmäisissä tapauksissa tämä voi liittyä vääriin negatiivisiin tuloksiin. Paljon aikaa voidaan säästää keittämällä lyysi tai entsymaattisella solujätteen pilkkomisella, mutta tämä menetelmä johtaa usein alhaiseen PCR-herkkyyteen riittämättömän nukleiinihappojen vapautumisen vuoksi.

Polymeraasiaktiivisuuden esto monistuksen aikana

Yleisesti ottaen esto-ongelmaa käytetään säiliökäsitteenä kuvaamaan kaikkia tekijöitä, jotka johtavat epäoptimaalisiin PCR-tuloksiin. Pelkästään biokemiallisessa mielessä esto-ongelma rajoittuu entsyymin aktiivisuuteen eli se vähentää tai estää substraatti-tuote-muunnoksen vuorovaikutuksessa DNA-polymeraasin tai sen kofaktorin aktiivisen kohdan kanssa (esim. Mg2+ Taq-DNA-polymeraasin tapauksessa).
Näytteen komponentit tai erilaiset puskurit ja uutteet, jotka sisältävät reagensseja, voivat estää entsyymiä suoraan tai sitoa sen kofaktoreita (esim. EDTA), mikä inaktivoi polymeraasin ja johtaa heikentyneisiin tai vääriin negatiivisiin PCR-tuloksiin.
Monet reaktiokomponenttien ja kohdetta sisältävien nukleiinihappojen väliset vuorovaikutukset nimetään kuitenkin myös 'PCR-estäjiksi'. Kun solun eheys on häiriintynyt eristämisen vuoksi ja nukleiinihappo vapautuu, näytteen ja sitä ympäröivän liuoksen ja kiinteän faasin välillä voi esiintyä vuorovaikutuksia. Esimerkiksi 'siepparit' voivat sitoa yksi- tai kaksijuosteista DNA:ta ei-kovalenttisten vuorovaikutusten kautta ja häiritä eristämistä ja puhdistamista vähentämällä PCR-reaktioastiaan lopulta päätyvien kohteiden määrää.
Yleisesti ottaen PCR-estäjiä on useimmissa kehon nesteissä ja kliinisissä diagnostisissa testeissä käytettävissä reagensseissa (urea virtsassa, hemoglobiini ja hepariini veressä), ravintolisissä (orgaaniset komponentit, glykogeeni, rasva, Ca2+-ionit) ja ympäristön komponenteissa (fenolit, raskasmetallit).

Yleisempiä PCR-estäjiä löytyy bakteereista ja eukaryoottisoluista, ei-kohde-DNA:sta, kudosmatriisien DNA:ta sitovista makromolekyyleistä ja laboratoriovälineistä, kuten käsineistä ja muoveista. Nukleiinihappojen puhdistaminen uuttamisen aikana tai sen jälkeen on ensisijainen menetelmä PCR-estäjien poistamiseksi.
Nykyään erilaiset automatisoidut uuttolaitteet voivat korvata monia manuaalisia protokollia, mutta kohteiden 100 %:n talteenottoa ja/tai puhdistusta ei ole koskaan saavutettu. Puhdistettuissa nukleiinihapoissa voi edelleen olla mahdollisia inhibiittoreita tai ne ovat jo voineet vaikuttaa. Inhibiittorien vaikutuksen vähentämiseksi on olemassa erilaisia ​​strategioita. Sopivan polymeraasin valinnalla voi olla merkittävä vaikutus inhibiittorin aktiivisuuteen. Muita todistettuja menetelmiä PCR-inhibition vähentämiseksi ovat polymeraasipitoisuuden lisääminen tai lisäaineiden, kuten BSA:n, käyttö.
PCR-reaktioiden esto voidaan osoittaa sisäisen prosessinlaadunvalvonnan (IPC) avulla.
Kaikki uuttopakkauksen reagenssit ja muut liuokset, kuten etanoli, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanoli ja fenoli, on poistettava huolellisesti nukleiinihappoisolaatista perusteellisella pesuvaiheella. Ne voivat pitoisuudestaan ​​riippuen aktivoida tai estää PCR:ää.