Neljän nukleiinihappojen monistusmäärityksen suorittaminen SARS-CoV-2:n tunnistamiseksi Etiopiassa

Kiitos, että kävit Nature.com-sivustolla. Käytät selainversiota, jossa on rajoitettu CSS-tuki. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Lisäksi jatkuvan tuen varmistamiseksi näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Näyttää kolmen dian karusellin kerralla. Siirry kolmen dian läpi kerrallaan Edellinen- ja Seuraava-painikkeilla tai siirry kolmen dian läpi kerrallaan lopussa olevilla liukusäätimen painikkeilla.
Vuoden 2019 koronavirustaudin (COVID-19) puhkeamisen jälkeen ympäri maailmaa on kehitetty monia kaupallisia nukleiinihappojen monistustestejä (NAAT), joista on tullut standardimäärityksiä. Vaikka useita testejä kehitettiin nopeasti ja niitä sovellettiin laboratoriodiagnostiikkaan, näiden testien suorituskykyä ei ole arvioitu useissa eri ympäristöissä. Siksi tässä tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan Abbott SARS-CoV-2-, Daan Gene-, BGI- ja Sansure Biotech -määritysten suorituskykyä käyttämällä Composite Reference Standardia (CRS). Tutkimus tehtiin Etiopian kansanterveysinstituutissa (EPHI) 1.–30. joulukuuta 2020. 164 nenänielun näytettä otettiin käyttämällä QIAamp RNA mini -pakkausta ja Abbott DNA -näytteenvalmistusjärjestelmää. 164 näytteestä 59,1 % oli positiivisia ja 40,9 % negatiivisia CRS:n suhteen. Sansure Biotechin positiivisuus oli merkitsevästi matalampi verrattuna CRS:ään (p < 0,05). Sansure Biotechin positiivisuus oli merkitsevästi matalampi verrattuna CRS:ään (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotechin positiiviset tulokset olivat merkittävästi alhaisemmat kuin CRS:n (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）.与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）. У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotechillä oli merkittävästi vähemmän positiivisia tuloksia verrattuna CRS:ään (p < 0,05).Neljän analyysin kokonaisyhteensopivuus oli 96,3–100 % CRS:ään verrattuna. Sansure Biotech -määrityksen alhaisen positiivisuusprosentin lisäksi neljän määrityksen suorituskyky oli lähes vertailukelpoinen. Siksi Sansure Biotech [vain tutkimuskäyttöön (RUO)] -määritys vaatii lisävalidointia sen käyttöön Etiopiassa. Lopuksi tulisi harkita lisätutkimuksia määritysten arvioimiseksi asianmukaisten valmistajien väitteiden mukaisesti.
Laboratoriotestaus on osa Maailman terveysjärjestön (WHO) strategista koronavirustaudin (COVID-19) valmius- ja reagointisuunnitelmaa vuodelle 2019 (SPRP). WHO suosittelee, että maat rakentavat laboratoriokapasiteettia parantaakseen valmiutta, asianmukaista tapausten hallintaa, valppautta ja nopeaa reagointia kansanterveyteen liittyviin haasteisiin. Tämä viittaa siihen, että laboratorion rooli on keskeinen taudin karakterisoinnissa ja uusien tartuntatautien epidemiologiassa sekä niiden leviämisen hillitsemisessä.
COVID-19-diagnoosi vaatii epidemiologisia ja lääketieteellisiä tietoja, henkilökohtaisia ​​oireita/löydöksiä sekä röntgen- ja laboratoriotietoja2. Sen jälkeen, kun COVID-19-epidemia raportoitiin Wuhanissa, Kiinassa, ympäri maailmaa on kehitetty useita kaupallisia nukleiinihappojen monistustestejä (NAAT). Reaaliaikaista käänteiskopiointipolymeraasiketjureaktiota (rRT-PCR) on käytetty rutiininomaisena ja standardimenetelmänä vakavan akuutin hengitystieoireyhtymän 2 (SARS-CoV-2)3 laboratoriodiagnostiikassa. SARS-CoV-2:n molekyylitason havaitseminen perustuu tyypillisesti virusgenomista tunnistettuihin N- (nukleokapsidiproteiinigeeni), E- (vaippaproteiinigeeni) ja RdRp- (RNA-riippuvainen RNA-polymeraasigeeni) geeneihin ORF1a/b-alueella (avoin lukukehys 1a/b). Näitä pidetään virusgenomien tärkeimpinä konservoituneina alueina virusten tunnistamiseksi4. Näistä geeneistä RdRp- ja E-geeneillä on korkea analyyttinen havaitsemisherkkyys, kun taas N-geenillä on matala analyyttinen herkkyys5.
PCR-määritysten suorituskyky voi vaihdella useiden tekijöiden, kuten uuttoreagenssien, monistus-/detektioreagenssien, uuttomenetelmän, PCR-laitteen laadun ja muiden instrumenttien, mukaan. Huhtikuuhun 2020 mennessä yli 48 erilaista diagnostista laitetta yhdeksästä maasta oli saanut hätäkäyttöluvan (EUA) COVID-196-diagnostiikkaan. Etiopiassa käytetään yli 14 reaaliaikaista PCR-alustaa SARS-CoV-2:n PCR-havaitsemiseen 26 julkisessa terveydenhuollon laitoksessa, mukaan lukien ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 ja Quant-studio7. Lisäksi saatavilla on erilaisia ​​PCR-testipakkauksia, kuten Daan Gene -testi, Abbott SARS-CoV-2 -testi, Sansure Biotech -testi ja SARS-CoV-2 BGI -testi. Vaikka rRT-PCR on erittäin herkkä, jotkut COVID-19-potilaat raportoivat vääriä negatiivisia tuloksia johtuen riittämättömistä viruksen ribonukleiinihapon (RNA) kopioista näytteissä virheellisen keräyksen, kuljetuksen, varastoinnin ja käsittelyn sekä laboratoriotestauksen, olosuhteiden ja henkilöstön toimien vuoksi8. Lisäksi näytteen tai kontrollin virheellinen käsittely, syklikynnyksen (Ct) asettaminen ja ristireaktiivisuus muiden patogeenisten nukleiinihappojen tai inaktiivisen/jäännös SARS-CoV-2-RNA:n kanssa voivat johtaa vääriin positiivisiin tuloksiin rRT-PCR9-määrityksissä. Siten on selvää, että PCR-testit voivat todellakin tunnistaa geenifragmenttien kantajia, koska ne eivät pysty edes erottamaan todella aktiivisia virusgeenejä, joten testit voivat tunnistaa vain kantajia, eivät potilaita10. Siksi on tärkeää arvioida diagnostista suorituskykyä standardimenetelmillä omassa ympäristössämme. Vaikka Etiopian kansanterveyslaitoksessa (EPHI) ja koko maassa on saatavilla monia NAAT-reagensseja, niiden tehokkuudesta ei ole vielä raportoitu vertailevaa arviointia. Siksi tässä tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan kaupallisesti saatavilla olevien SARS-CoV-2:n havaitsemiseen tarkoitettujen rRT-PCR-reagenssisarjojen vertailukelpoista suorituskykyä kliinisistä näytteistä.
Tutkimukseen otettiin mukaan yhteensä 164 osallistujaa, joilla epäiltiin COVID-19-tartuntaa. Suurin osa näytteistä oli peräisin hoitokeskuksista (118/164 = 72 %), kun taas loput 46 (28 %) osallistujaa olivat muista kuin hoitokeskuksista. Keskuksessa hoitamattomista osallistujista 15:llä (9,1 %) oli kliinisesti epäilty tartunta ja 31:llä (18,9 %) oli kontakteja vahvistettujen tartuntojen kanssa. Osallistujista 93 (56,7 %) oli miehiä, ja osallistujien keski-ikä (± keskihajonta) oli 31,10 (± 11,82) vuotta.
Tässä tutkimuksessa määritettiin neljän COVID-19-testin positiivisten ja negatiivisten tulosten osuudet. Näin ollen Abbott SARS-CoV-2 -määrityksen, Daan Gene 2019-nCoV -määrityksen, SARS-CoV-2 BGI -määrityksen ja Sansure Biotech 2019-nCoV -määrityksen positiiviset osuudet olivat vastaavasti 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % ja 55,5 %. Positiiviset ja negatiiviset yhdistetyn vertailustandardin (CRS) pisteet olivat 97 (59,1 %) ja 67 (40,9 %) (taulukko 1). Tässä tutkimuksessa CRS:n määritelmä perustui "mikä tahansa positiivinen" -sääntöön, jonka mukaan neljästä testituloksesta kahta tai useampaa saman tuloksen antanutta testitulosta pidettiin todella positiivisena tai negatiivisena.
Tässä tutkimuksessa havaitsimme 100 %:n negatiivisen prosentuaalisen yhtäpitävyyden (NPA) (95 %:n luottamusväli 94,6–100) kaikissa analyyseissä verrattuna CRS:ään. Sansure Biotechnologyn analyysi osoitti minimaalisen PPA:n, 93,8 % (95 %:n luottamusväli 87,2–97,1), ja Daan Gene 2019-nCoV -analyysin kokonaisyhteensopivuus oli 99,4 % (95 %:n luottamusväli 96,6–99,9). Sitä vastoin SARS-CoV-2 BGI -määrityksen ja Sansure Biotech 2019-nCoV -määrityksen välinen kokonaisyhteensopivuus oli 98,8 % ja 96,3 % (taulukko 2).
Cohenin kappa-yhtäpitävyyskerroin CRS:n ja Abbott SARS-CoV-2 -määritystulosten välillä oli täysin yhdenmukainen (K = 1,00). Vastaavasti Daan Gene 2019-nCoV:n, SARS-CoV-2 BGI:n ja Sansure Biotech 2019-nCoV:n avulla havaitut Cohenin kappa-arvot ovat myös täysin yhdenmukaisia ​​CRS:n kanssa (K ≥ 0,925). Tässä vertailevassa analyysissä khiin neliö -testi (McNemar-testi) osoitti, että Sansure Biotech 2019-nCoV -määritystulokset poikkesivat merkitsevästi CRS-tuloksista (p = 0,031) (taulukko 2).
Kuten kuvassa on esitetty.1 Abbott SARS-CoV-2 -määrityksen (yhdistetty RdRp- ja N-geeni) alhaisimman Ct-arvon (< 20 Ct) prosenttiosuus oli 87,6 % ja Sansure Biotech 2019-nCoV -määrityksen ORF1a/b-geenin Ct-arvo osoitti, että matalan Ct-arvon (< 20 Ct) prosenttiosuus oli 50,3 % ja korkean Ct-arvon (36–40 Ct) prosenttiosuus oli 3,2 %. 1 Abbott SARS-CoV-2 -määrityksen (yhdistetty RdRp- ja N-geeni) alhaisimman Ct-arvon (< 20 Ct) prosenttiosuus oli 87,6 % ja Sansure Biotech 2019-nCoV -määrityksen ORF1a/b-geenin Ct-arvo osoitti, että matalan Ct-arvon (< 20 Ct) prosenttiosuus oli 50,3 % ja korkean Ct-arvon (36–40 Ct) prosenttiosuus oli 3,2 %.Kuten kuvassa on esitetty.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, егаезначе ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3%, а высоче6–40t osuus 3,2 %. 1. Abbott SARS-CoV-2:n (yhdistetty geeni RdRp ja N) alhaisimman Ct-arvon (< 20 Ct) prosenttiosuus analyysissä oli 87,6 %, ja Sansure Biotech 2019-nCoV:n ORF1a/b-geenin Ct-arvon analyysi osoitti, että matalan Ct-arvon (< 20 Ct) osuus oli 50,3 % ja korkean Ct-arvon (36–40 Ct) osuus 3,2 %.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20，，8an二S. 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3 %，高Ct 值 Ct(36)的百分比为3,2 %. Kuten kuvassa 1 on esitetty, Abbott SARS-CoV-2 -testin (RdRp- ja N-geenin yhdistelmä) alhaisimman Ct-arvon prosenttiosuus (< 20 Ct) on 87,6 %, Sansure Biotech 2019-nCoV -testin ORF1a/b-geenin Ct-arvo on alhainen (< 20 Ct) 50,3 % ja ORF1a/b-geenin Ct-arvo (36–40 Ct) 3,2 %. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное низкое процентное значент размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV показал низкий Ct. Kuten kuvassa 1 on esitetty, Abbott SARS-CoV-2 -määrityksellä (jossa yhdistettiin RdRp- ja N-geenit) oli pienin Ct-prosenttiarvo (< 20 Ct), 87,6 %, kun taas Sansure Biotechin vuoden 2019 tutkimuksessa ORF1a/b-geenin Ct-arvo – nCoV-analyysi osoitti matalan Ct-arvon. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 3,2%. Arvojen (< 20 Ct) osuus oli 50,3 % ja korkeiden Ct-arvojen (36–40 Ct) osuus oli 3,2 %.Abbottin SARS-CoV-2 B -testissä Ct-arvot olivat yli 30. Toisaalta BGI SARS-CoV-2 -määrityksessä ORF1a/b-geenillä oli korkea Ct-arvo (> 36 Ct), ja sen prosenttiosuus oli 4 % (kuva 1). Toisaalta BGI SARS-CoV-2 -määrityksessä ORF1a/b-geenillä oli korkea Ct-arvo (> 36 Ct), ja sen prosenttiosuus oli 4 % (kuva 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого составрис.41% (). Toisaalta BGI-analyysissä SARS-CoV-2-geenillä ORF1a/b oli korkea Ct-arvo (> 36 Ct), jonka prosenttiosuus oli 4 % (kuva 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为的百分比为 Toisaalta BGI SARS-CoV-2 -tunnistuksessa ORF1a/b-geenin korkean Ct-arvon (>36 Ct) prosenttiosuus on 4 % (kuva 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) составил 4 % (рис. Toisaalta BGI SARS-CoV-2 -analyysissä ORF1a/b-geenien, joilla oli korkeat Ct-arvot (> 36 Ct), prosenttiosuus oli 4 % (kuva 1).
Tässä tutkimuksessa otimme 164 nenänielun näytettä. Kaikissa määritystyypeissä RNA:n eristäminen ja monistaminen suoritettiin käyttämällä valmistajien suosittelemia menetelmiä ja testipakkauksia.
Tämä tutkimus osoitti, että Abbottin SARS-CoV-2-testillä on sama havaitsemiskyky kuin CRS:llä, 100 %:n positiivisella, negatiivisella ja kokonaiskonkordanssilla. Cohenin kappa-yhteensopivuus on 1,00, mikä osoittaa täyden yhteensopivuuden CRS:n kanssa. Washingtonin yliopiston Yhdysvalloissa tekemässä vastaavassa tutkimuksessa havaittiin, että Abbottin SARS-CoV-2-testin kokonaisherkkyys ja spesifisyys oli 93 % ja 100 % verrattuna CDC:n laboratoriossa määritettyyn määritykseen (LDA).11. Abbottin SARS-CoV-2-havaitsemisjärjestelmä perustuu N- ja RdRp-geenien samanaikaiseen yhdistettyyn havaitsemiseen, koska molemmat geenit ovat herkempiä, mikä minimoi vääriä negatiivisia12. Wienissä, Itävallassa, tehty tutkimus osoitti myös, että suuret uuttonäytteen tilavuudet ja havaitsemiseluenttitilavuudet minimoivat laimennusvaikutukset ja lisäsivät havaitsemistehokkuutta13. Siten Abbottin täydellinen SARS-CoV-2-määrityksen osuma voidaan yhdistää alustan havaitsemisjärjestelmään, joka samanaikaisesti havaitsee kombinatorisia geenejä, erottaa suuren määrän näytteitä (0,5 ml) ja käyttää suurta määrää eluenttia (40 µl).
Tuloksemme osoittivat myös, että Daan-geenitestin havaitsemiskyky oli lähes sama kuin CRS:n. Tämä on yhdenmukaista Anhuin yliopistossa Huainanissa, Kiinassa, tehdyn tutkimuksen14 ja valmistajan väitteen kanssa, jonka mukaan positiivinen tulos oli 100 %. Huolimatta raporteista johdonmukaisista tuloksista, yksi näyte oli väärä negatiivinen saman eluaatin uudelleentestauksen jälkeen, mutta positiivinen Abbott SARS-CoV-2- ja Sansure Biotech nCoV-2019 -määrityksissä. Tämä viittaa siihen, että tuloksissa voi olla vaihtelua erityyppisten määritysten välillä. Kiinassa tehdyssä tutkimuksessa15 Daan-geenimäärityksen tulos oli kuitenkin merkittävästi erilainen (p < 0,05) verrattuna laboratoriossa määriteltyyn vertailumääritykseen. Kiinassa tehdyssä tutkimuksessa15 Daan-geenimäärityksen tulos oli kuitenkin merkittävästi erilainen (p < 0,05) verrattuna laboratoriossa määriteltyyn vertailumääritykseen. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) эталонного анализа. Kiinassa tehdyssä tutkimuksessa15 Daan Genen analyysitulos poikkesi kuitenkin merkittävästi (p < 0,05) heidän laboratoriovertailuanalyysistään.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (05p) вра он0,05p его эталонным labboраторным тестом. Kiinassa tehdyssä tutkimuksessa15 Daanin geenitestin tulokset olivat kuitenkin merkittävästi erilaiset (p < 0,05) verrattuna sen referenssilaboratoriotestiin.Tämä ero voi johtua SARS-CoV-2:n havaitsemiseen käytetyn referenssitestin herkkyydestä, ja lisätutkimukset voivat olla tärkeitä syyn selvittämiseksi.
Lisäksi tutkimuksessamme arvioitiin SARS-CoV-2 BGI -määrityksen ja CRS:n vertailukelpoisuutta ja osoitettiin erinomainen positiivinen prosentuaalinen yhteensopivuus (PPA = 97,9 %), negatiivinen prosentuaalinen yhteensopivuus (NPA = 100 %) ja sukupuolen mukainen kokonaisyhteensopivuus (OPA). = 98,8 %). Cohenin kappa-arvot osoittivat hyvää yhteensopivuutta (K = 0,975). Alankomaissa16 ja Kiinassa15 tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet yhdenmukaisia ​​tuloksia. SARS-CoV-2 BGI -testi on yhden geenin (ORF1a/b) havaitsemistesti, jossa käytetään 10 µl:n amplifikaatio-/havaitsemiseluaattia. Huolimatta hyvästä tilastollisesta yhteensopivuudesta vertailutulostemme kanssa, analyysistä puuttui kaksi positiivista näytettä (1,22 %) kokonaisnäytteestä. Tällä voi olla valtavia kliinisiä vaikutuksia tartuntadynamiikkaan sekä potilas- että yhteisötasolla.
Toinen tässä tutkimuksessa käytetty vertaileva analyysi oli Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO) -määritys; kokonaisosumaprosentti oli 96,3 %. Yhtäpitävyyden voimakkuutta määritti myös Cohenin kappa-arvo, joka oli 0,925, mikä osoittaa täyden yhtäpitävyyden CRS:n kanssa. Tuloksemme ovat jälleen identtisiä Central South Universityssa Changshassa, Kiinassa, ja Liuzhoun kansansairaalan kliinisen laboratorion osastolla Liuzhoun kaupungissa, Kiinassa, tehtyjen tutkimusten kanssa17. Vaikka edellä mainittu hyvä tilastollinen konkordanssi saavutettiin, khiin neliö -testi (MacNemar-testi) osoitti, että Sansure Biotech -määrityksen tuloksella oli tilastollisesti merkitsevä ero CRS:ään verrattuna (p < 0,005). Vaikka edellä mainittu hyvä tilastollinen konkordanssi saavutettiin, khiin neliö -testi (MacNemar-testi) osoitti, että Sansure Biotech -määrityksen tuloksella oli tilastollisesti merkitsevä ero CRS:ään verrattuna (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-крийтрийкрий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие по сравнению < с0,005. Vaikka edellä mainittu hyvä tilastollinen yhteensopivuus havaittiin, khiin neliö -testi (McNemar-testi) osoitti, että Sansure Biotech -määrityksen tuloksella oli tilastollisesti merkitsevä ero CRS-testiin verrattuna (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，RSSansure Biotech.相比具有统计学显着差异（p < 0,005）.尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 棋 tech 棨明 ， bio与 crs 相比 具有 显着 （(p <0.005。。。。。。。。。。。。。。。。））。。。（（（ Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемаза) статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech ja CRS. Edellä mainitusta hyvästä tilastollisesta yhteensopivuudesta huolimatta khiin neliö -testi (McNemar-testi) osoitti tilastollisesti merkitsevän eron (p < 0,005) Sansure Biotech -määrityksen ja CRS:n välillä.Kuusi näytettä (3,66 %) todettiin vääriksi negatiivisiksi verrattuna CRS:ään (lisätaulukko 1); tämä on erittäin tärkeää, erityisesti ottaen huomioon viruksen leviämisdynamiikan. Yllä olevat tiedot tukevat myös tätä alhaista havaitsemisastetta15.
Tässä tutkimuksessa Ct-arvot määritettiin kullekin määritykselle ja vastaavalle alustalle, ja Abbott SARS-CoV-2 -määrityksessä raportoitiin pienin keskimääräinen Ct-arvo. Tämä tulos saattaa liittyä Abbottin samanaikaiseen yhdistettyyn geneettiseen testausjärjestelmään SARS-CoV-2:n havaitsemiseksi. Näin ollen kuvan 1 mukaan 87,6 %:lla Abbott SARS-CoV-2 -tuloksista oli alle 20:n Ct-arvo. Vain pieni osa näytetuloksista (12,4 %) oli välillä 20–30. Yli 30:n Ct-arvoja ei kirjattu. Sen lisäksi, että Abbott käytti SARS-CoV-2-paneeligeneettisen testausformaatin muotoa, tämä tulos voi liittyä Abbottin havaitsemisrajaan (32,5 RNA-kopiota/ml),18 joka on kolme kertaa alhaisempi kuin yrityksen alaraja 100 RNA-kopiota/ml.19.
Tässä tutkimuksessa on joitakin rajoituksia: ensinnäkin meillä ei ole standardi-/vertailumenetelmiä [kuten viruskuorman tai muiden laboratoriotestien (LDA)] resurssien puutteen vuoksi. Toiseksi, kaikki tässä tutkimuksessa käytetyt näytteet olivat nenänielun limakalvonäytteitä, eivätkä tulokset olleet sovellettavissa muihin näytetyyppeihin, ja kolmanneksi, otoskokomme oli pieni.
Tässä tutkimuksessa verrattiin neljän rRT-PCR-määrityksen suorituskykyä SARS-CoV-2:n havaitsemiseksi nenänielun näytteitä käyttäen. Kaikkien havaitsemismääritysten suorituskyky oli lähes vertailukelpoinen Sansure Biotech -määritystä lukuun ottamatta. Lisäksi Sansure Biotech -määrityksessä havaittiin alhainen positiivisuusprosentti verrattuna CRS-määritykseen (p < 0,05). Lisäksi Sansure Biotech -määrityksessä havaittiin alhainen positiivisuusprosentti verrattuna CRS-määritykseen (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Lisäksi Sansure Biotech -testissä positiivisten tulosten prosenttiosuus oli alhainen CRS:ään verrattuna (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05). Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Lisäksi Sansure Biotech -määrityksellä oli alhaisempi positiivisten tulosten määrä verrattuna CRS:ään (p < 0,05).Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) -analyysin PPA:n, NPA:n ja kokonaisyhtäpitävyyden analyysi ylitti 93,5 %, ja Cohenin kappa -yhtäpitävyysarvo oli 0,925. Lopuksi Sansure Biotech Assay (RUO) vaatii lisävalidointia käytettäväksi Etiopiassa, ja yksittäisten valmistajien väitteiden arvioimiseksi tulisi harkita lisätutkimuksia.
Vertaileva tutkimusasetelma toteutettiin neljässä Addis Abeban terveyskeskuksessa: Eka Kotebe -sairaalassa, Millennium Church Treatment Centressä, Zewooditu Memorial -sairaalassa ja St. Peter's Tuberculosis Specialist -sairaalassa. Tiedot kerättiin 1.–31. joulukuuta 2020. Tutkimukseen tarkoitetut lääketieteelliset laitokset valittiin tarkoituksella niiden suuren tapausmäärän ja kaupungin tärkeimpien hoitokeskusten saatavuuden perusteella. Samoin laitteet, mukaan lukien ABI 7500- ja Abbott m2000 -reaaliaikaiset PCR-laitteet, valittiin NAAT-reagenssivalmistajien suositusten mukaisesti, ja tutkimukseen valittiin neljä PCR-detektiopakkausta, koska useimmat Etiopian laboratoriot käyttivät vähintään neljää niistä. Geenitesti, Abbott SARS-CoV-2 -testi, Sansure Biotech -testi ja SARS-CoV-2 BGI -testi suoritettiin tutkimuksen aikana.
SARS-CoV-2-testaus tehtiin 1.–30. joulukuuta 2020 käyttäen 3 ml Viral Transport Medium (VTM) -elatusainetta (Miraclean Technology, Shenzhen, Kiina) henkilöiltä, ​​jotka olivat COVID-19-tutkinnan alaisia ​​ja lähetettiin EPHI:hin. Koulutetut näytteenkerääjät keräsivät nenänielun näytteet ja lähettivät ne EPHI:hin kolmen pakkauksissa. Ennen nukleiinihappojen eristämistä jokaiselle näytteelle annetaan yksilöllinen tunnistenumero. Uutto suoritetaan jokaisesta näytteestä välittömästi saapumisen jälkeen manuaalisilla ja automaattisilla uuttomenetelmillä. Abbott m2000:n automaattista uuttoa varten kustakin näytteestä uutettiin 1,3 ml (mukaan lukien 0,8 ml kuollut tilavuus ja 0,5 ml uuton sisääntulotilavuus) näytettä ja johdettiin Abbott DNA -näytteenvalmistusjärjestelmän (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA) läpi. ) SARS-CoV-2 (EUA) -viruksen kahden reaaliaikaisen louhintakierroksen kokonaisprosessiin (haku ja havaitseminen) sisällytettiin 96 näytteen erä [92 näytettä, kaksi havaitsemiskontrollia ja kaksi ei-templaattikontrollia (NTC)]. Samoin manuaalisessa uutossa käytetään samoja näytteitä (automaattista uuttoa ja löytämistä varten). Näin ollen koko prosessin ajan 140 µl:n näytteet jaettiin eriin ja uutettiin QIAamp Viral RNA Mini Kit -pakkauksella (QIAGEN GmbH, Hilden, Saksa) 24 näytteen erissä (mukaan lukien 20 näytettä, kaksi määrityskontrollia ja kaksi NTC:tä) yhdeksän kierroksen aikana. Manuaalisesti uutetut eluaatit monistettiin ja havaittiin ABI 7500 -lämpösyklerillä käyttäen SARS-CoV-2 BGI -määritystä, Daan Gene -määritystä ja Sansure Biotech -määritystä.
SARS-CoV-2-viruksen RNA:n automaattinen eristäminen ja puhdistaminen tapahtuu magneettihelmiperiaatteella käyttäen Abbottin DNA-näytteenvalmistusreagensseja. Näytteiden inaktivointi ja viruspartikkelien liuottaminen suoritetaan käyttämällä guanidiini-isotiosyanaattia sisältävää pesuainetta proteiinin denaturoimiseksi ja RNaasin inaktivoimiseksi. Sitten RNA erotetaan proteiinista kiinteäfaasierotuksella käyttäen piidioksidia, eli guanidiniumsuola ja lyysipuskurin emäksinen pH edistävät nukleiinihappojen sitoutumista piidioksidiin (SiO2). Huuhteluvaiheessa jäljelle jääneet proteiinit ja roskat poistetaan kirkkaan liuoksen tuottamiseksi. Läpinäkyvä RNA eristetään piidioksidipohjaisista mikropartikkeleista laitteen magneettikentän avulla20,21. Toisaalta RNA:n manuaalinen eristäminen ja puhdistaminen suoritetaan spinkolonnimenetelmällä käyttäen sentrifugointia magneettijalustan sijaan ja mikropartikkelien erottamista eluentista.
Abbott Real-Time SARS-CoV-2 -testi (Abbott Molecular, Inc.) suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti, jotka saivat EUA19,22 WHO:lta ja FDA:lta. Tässä protokollassa näytteen inaktivointi ennen uuttamista suoritettiin vesihauteessa 56 °C:ssa 30 minuutin ajan. Viruksen inaktivoinnin jälkeen nukleiinihappojen uutto suoritettiin Abbott m2000 SP -laitteella 0,5 ml:sta VTM:ää käyttäen Abbott m2000 DNA-näytteenvalmistusjärjestelmää valmistajan ohjeiden mukaisesti. Monistus ja havaitseminen suoritettiin Abbott m2000 RT-PCR -laitteella, ja kaksoisdetektio suoritettiin RdRp- ja N-geeneille. Sisäisten kontrollien kohdentamiseen ja havaitsemiseen käytettiin ROX:ia ja VIC P:tä (patentoitu väriaine), mikä mahdollisti molempien monistustuotteiden samanaikaisen havaitsemisen19.
Tämän pakkauksen monistuksen havaitsemismenetelmä perustuu yksivaiheiseen RT-PCR-tekniikkaan. Daan Gene Technology valitsi ORF1a/b- ja N-geenit konservoituneiksi alueiksi kohdealueiden monistuksen havaitsemiseksi. Spesifiset alukkeet ja fluoresoivat koettimet (FAM-leimatut N-geenikoettimet, VIC-leimatut ORF1a/b-koettimet) on suunniteltu SARS-CoV-2 RNA:n havaitsemiseksi näytteistä. Lopullinen eluentti ja pääseos valmistettiin lisäämällä 5 µl eluenttia 20 µl:aan pääseosta lopulliseen tilavuuteen 25 µl. Monistus ja havaitseminen suoritettiin samanaikaisesti ABI 750024 -reaaliaikaisella PCR-laitteella.
ORF1a/b- ja N-geenit havaittiin käyttämällä Sansure Biotech nCoV-2019 -nukleiinihappodiagnostiikkapakkausta (fluoresoiva PCR-detektio). Valmistele kullekin kohdegeenille spesifiset koettimet valitsemalla FAM-kanava ORF1a/b-alueelle ja ROX-kanava N-geenille. Tähän määrityspakkaukseen lisätään eluentti ja pääseosreagenssit seuraavasti: valmistele 30 µl pääseosreagenssia ja 20 µl eluoitua näytettä detektiota/monistusta varten. Monistukseen/detektioon käytettiin reaaliaikaista PCR ABI 750025 -laitetta.
SARS-CoV-2 BGI -testi on fluoresoiva reaaliaikainen rRT-PCR-kitti COVID-19:n diagnosointiin. Kohdealue sijaitsee SARS-CoV-2-genomin ORF1a/b-alueella, mikä on yhden geenin havaitsemismenetelmä. Lisäksi ihmisen talonpitogeeni β-aktiini on sisäisesti säädelty kohdegeeni. Pääseos valmistetaan sekoittamalla 20 µl pääseosreagenssia ja 10 µl uutettua RNA-näytettä kuoppalevyllä26. Monistamiseen ja havaitsemiseen käytettiin ABI 7500 -fluoresoivaa kvantitatiivista reaaliaikaista PCR-laitetta. Kaikki nukleiinihappojen monistukset, PCR-ajo-olosuhteet kullekin määritykselle ja tulosten tulkinta suoritettiin kunkin valmistajan ohjeiden mukaisesti (taulukko 3).
Tässä vertailevassa analyysissä emme käyttäneet referenssistandardimenetelmää neljän analyysin yhtäpitävyysprosentin (positiivinen, negatiivinen ja kokonaistulos) ja muiden vertailuparametrien määrittämiseen. Jokainen testivertailu tehtiin CRS:llä. Tässä tutkimuksessa CRS asetettiin "mikä tahansa positiivinen" -säännöllä ja tulos määritettiin yhden testin, ei yhden testin, perusteella. Käytimme vähintään kahta vastaavaa testitulosta. Lisäksi COVID-19-tartunnan tapauksessa väärät negatiiviset tulokset ovat vaarallisempia kuin väärät positiiviset tulokset. Siksi, jotta CRS-tuloksesta voidaan sanoa mahdollisimman tarkasti "positiivinen", vähintään kahden määritystestin on oltava positiivisia, mikä tarkoittaa, että vähintään yksi positiivinen tulos on todennäköisesti peräisin EUA-määrityksestä. Näin ollen neljästä testituloksesta kahta tai useampaa saman tuloksen antavaa testitulosta pidetään todella positiivisena tai negatiivisena18,27.
Tiedot kerättiin strukturoiduilla tiedonkeruulomakkeilla, ja tiedot syötettiin ja analysoitiin Excel-tilasto-ohjelmistolla ja SPSS-ohjelmiston versiolla 23.0 kuvailevaa tilastoa varten. Positiivinen, negatiivinen ja yleinen prosentuaalinen yhtäpitävyys analysoitiin, ja kappa-pisteitä käytettiin kunkin menetelmän ja CRS:n välisen yhtäpitävyyden asteen määrittämiseen. Kappa-arvot tulkittiin seuraavasti: 0,01–0,20 lievälle yhtäpitävyydelle, 0,21–0,40 yleiselle yhtäpitävyydelle, 0,41–0,60 kohtalaiselle yhtäpitävyydelle, 0,61–0,80 suurelle yhtäpitävyydelle ja 0,81–0,99 täydelliselle yhtäpitävyydelle28.
Eettinen hyväksyntä saatiin Addis Abeban yliopistolta, ja Etiopian kansanterveysinstituutin tieteellisen eettisen arviointilautakunnan hyväksymät kaikki tutkimuksen kokeelliset protokollat. EPHI:n eettisen lisenssin viitenumero on EPHI/IRB-279-2020. Kaikkia menetelmiä sovellettiin Etiopian kansallisten COVID-19-hoidon kattavien ohjeiden suositusten ja määräysten mukaisesti. Lisäksi kaikilta tutkimukseen osallistujilta saatiin kirjallinen tietoinen suostumus ennen tutkimukseen osallistumista.
Kaikki tässä tutkimuksessa saadut tai analysoidut tiedot sisältyvät tähän julkaistuun artikkeliin. Tutkimuksen tuloksia tukevat tiedot ovat saatavilla kirjoittajilta kohtuullisesta pyynnöstä.
Maailman terveysjärjestö. Suositukset COVID-19-laboratoriotestausstrategioille: Väliaikainen ohjeistus, 21. maaliskuuta 2020 nro WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI COVID-19-älydiagnostiikka ensiavussa: Kaikki käytännössä. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI COVID-19-älydiagnostiikka ensiavussa: Kaikki käytännössä.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. ja Gurgulianis, KI COVID-19:n älykäs diagnosointi ensiavussa: kaikki käytännössä.Muliou DS, Pantazopoulos I. ja Gurgulyanis KI COVID-19:n älykäs diagnosointi ensiapupoliklinikoilla: kokonaisvaltainen integrointi käytännössä. Expert Reverend Respire. medicine. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. COVID19 ID NOW EUA -määrityksen arviointi. Mitchell, SL & St George, K. COVID19 ID NOW EUA -määrityksen arviointi.Mitchell, SL ja St. George, K. COVID19 ID NOW EUA -määrityksen arviointi.Mitchell SL ja St. George K. COVID19 ID NOW EUA -määrityksen arviointi. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
WHO. Koronavirustaudin 2019 (COVID-19) laboratoriotestaus epäillyillä ihmisillä esiintyvillä taudeilla. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (luettu 15. elokuuta 2020) (WHO, 2020).
Udugama, B. ym. COVID-19-diagnoosi: sairaudet ja testausvälineet. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. ym. Itä-, Keski- ja Etelä-Afrikan patologikoulun perustaminen – Lähi-idän ja Etelä-Afrikan alueellinen patologian koulu. Afrikka. J. Lab. medicine. 9(1), 1-8 (2020).
Etiopian kansanterveyslaitos, liittovaltion terveysministeriö. Väliaikainen kansallinen strategia ja ohjeet COVID-19:n laboratoriodiagnostiikkaan. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (luettu 12. elokuuta 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS. Vääriä negatiivisia SARS-CoV-2-testejä koskevat haasteet ja seuraukset. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS. Vääriä negatiivisia SARS-CoV-2-testejä koskevat haasteet ja seuraukset.Voloshin S., Patel N. ja Kesselheim AS Vääriä negatiivisia SARS-CoV-2-infektioiden testejä ja niiden seurauksia.Voloshin S., Patel N. ja Kesselheim AS. Vääriä negatiivisia testejä SARS-CoV-2-infektion provokaatioon ja vaikutukseen. N. eng. J. Medicine. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia COVID-19-tapauksia: Hengitysteiden ehkäisy- ja hoitostrategiat, rokotukset ja lisänäkökulmat. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia COVID-19-tapauksia: Hengitysteiden ehkäisy- ja hoitostrategiat, rokotukset ja lisänäkökulmat. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ложноположительные ja ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторная профилактечение истра,латечика и стра вакцинация и дальнейшие перспективы. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia COVID-19-tapauksia: hengitysteiden ehkäisy- ja hoitostrategiat, rokotukset ja tulevaisuus.Muliu, DS ja Gurgulianis, KI Vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia COVID-19-tapauksia: hengitystieinfektioiden ehkäisy- ja hoitostrategiat, rokotukset ja tulevaisuus. Expert Reverend Respire. medicine. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19-diagnoosi ensiavussa: Näkee puun, mutta menettää metsän. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19-diagnoosi ensiavussa: Näkee puun, mutta menettää metsän.Mouliou, DS, Ioannis, P. ja Konstantinos, G. COVID-19-diagnoosi ensiavussa: Näe puu, kadota metsä.Muliou DS, Ioannis P. ja Konstantinos G. COVID-19-diagnoosi ensiavussa: Ei tarpeeksi metsää puille. Appear. medicine. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. ym. Abbott RealTime SARS-CoV-2 -määrityksen analyyttisen ja kliinisen suorituskyvyn validointi ja validointi. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Viiden eri COVID-19-genomialueilta peräisin olevan alukeparin vertailu virusinfektion havaitsemiseksi tavanomaisella RT-PCR:llä. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Viiden eri COVID-19-genomialueilta peräisin olevan alukeparin vertailu virusinfektion havaitsemiseksi tavanomaisella RT-PCR:llä.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. ja Aflatunyan, B. Viiden eri COVID-19-genomin alueilta peräisin olevan alukesarjan vertailu virusinfektion havaitsemiseksi tavanomaisella RT-PCR:llä. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. COVID-19:n viiden eri geneettisen alueen vertailu virusinfektion havaitsemiseksi tavanomaisella RT-PCR:llä.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. ja Aflatunyan B. Viiden eri COVID-19-genomin alueilta peräisin olevan alukesarjan vertailu virusinfektion havaitsemiseksi tavanomaisella RT-PCR:llä.Iran. J. Microbiology. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. ym. SARS-CoV-2-genomisekvenssien havaitsemista koskevan kansallisen ulkoisen laadunarviointiohjelman alustavat tulokset. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. ym. Viiden RT-PCR-pakkauksen tehokkuuden analyyttinen arviointi vakavan akuutin hengitystieoireyhtymän (SUR) koronavirus 2:n hoidossa. J. Clinical. laboratory. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. ym. Seitsemän Kiinassa kaupallisesti saatavilla olevan SARS-CoV-2 RNA:n havaitsemispakkauksen arviointi reaaliaikaisen polymeraasiketjureaktion (PCR) perusteella. kliininen. Kemiallinen. Laboratorio. Lääketiede. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB ym. Seitsemän kaupallisen RT-PCR COVID-19 -diagnostiikkapakkauksen vertailu. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu ym. Kahden SARS-CoV-2-nukleiinihappojen havaitsemiseen tarkoitetun PCR-pakkauksen diagnostisen suorituskyvyn vertailu. J. Clinical. laboratory. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR jne. Neljän SARS-CoV-2-nukleiinihappojen monistustestausalustan (NAAT) vertaileva tutkimus osoitti, että ID NOW -testin suorituskyky heikkeni merkittävästi potilaasta ja näytetyypistä riippuen. diagnoosi. mikrobiologia. Infect. diss. 99(1), 115200 (2021).
Abbott-molekyyli. Abbottin reaaliaikaisen SARS-CoV-2-analyysin pakkausseloste. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (Tilanne 10. elokuuta 2020) (2020).
Klein, S. ym. SARS-CoV-2 RNA:n eristäminen magneettihelmillä nopeaa laajamittaista havaitsemista varten RT-qPCR:llä ja RT-LAMP:lla. Virus 12(8), 863 (2020).